Bron- en contactonderzoek bij een Mycobacterium bovis-infectie (2024)

Een Mycobacteriumbovis-infectie bij mensen kan verschillende oorzaken hebben.Directe overdracht van dier naar mens is mogelijk door geïnfecteerdvee, bijvoorbeeld door het drinken van ongepasteuriseerde melk (1)of door dieren in een dierentuin. (2) Zeldzamer is overdrachttussen mensen onderling. (3-5) In de periode 1993-2007 werden inNederland 16.059 patiënten geregistreerd met kweekpositievetuberculose (TB tuberculose (tuberculose)), waarvan 231 (1.44%) een M.bovis-infectie hadden. (6) Patiënten met een M.bovis-infectie hebben meestal extrapulmonale TB,slechts 35% heeft pulmonale TB. De meeste autochtonepatiënten met een M. bovis-infectie zijn ouder dan 60jaar, terwijl immigranten met een M. bovis-infectiemeestal jonger zijn. (7) In dit artikel beschrijven we voor deeerste keer het gebruik van de IGRA interferon-gamma release assay (interferon-gamma release assay) (deQuantiferon-Gold in tube (QFT-GIT)) voorcontactonderzoek in Nederland bij een jonge vrouw metTB, veroorzaakt door M. bovis.

Recent werd in onze regio eenuitzonderlijk geval van TB gediagnosticeerd. Bij een autochtone,23-jarige vrouw werd een pulmonale M. bovis-infectieaangetoond. De vrouw was als verpleegkundige werkzaam in eenverpleeghuis en had anderhalf jaar klachten van chronischproductief hoesten. Van haar sputum waren zowel hetZiehl-Neehlsenpreparaat positief, +4 volgens de schaal vanBronckhorst, als de PCR polymerase chain reaction (polymerase chain reaction) op M. tuberculosis-complex.De GGD Gemeentelijke Gezondheidsdienst (Gemeentelijke Gezondheidsdienst) startte een bron- en contactonderzoek op basisvan het ringprincipe om eventuele andere geïnfecteerde patiënten tevinden en daardoor ook de mogelijke bron van de infectie. (8,9)

Bij contactonderzoek en voor hetaantonen van een latente infectie wordt al meer dan 100 jaar detuberculinehuidtest (THT tuberculinehuidtest (tuberculinehuidtest)) gebruikt. DeTHT wordt gezet, via het principe van Mantoux, doorintradermaal purified protein derivaat (PPD)tuberculine te injecteren. Het ‘humane’PPD-tuberculine bestaat uit een ruw extract vanantigenen van M. tuberculosis en bevat daardoor ookantigenen van andere, nauw verwante, leden van het M.tuberculosis-complex, die ook voorkomen in M. bovisBacille Galmette-Guerin (BCG Bacille Calmette Guérin (Bacille Calmette Guérin)). (10)

Sinds enkele jaren zijn er ookinterferon-gamma release assays (IGRA’s) beschikbaarvoor het aantonen van een latente TB-infectie, terwijlsteeds meer onderzoek laat zien dat deze ook voor het aantonen vaneen recente actieve infectie gebruikt kunnen worden. (11,12) DezeIGRA’s zijn gebaseerd op de vorming vaninterferon-gamma door T-lymfocyten van besmette personen of dieren,na stimulatie met eiwitantigenen uit chromosomale region ofdifference 1 (RD1) van M. tuberculosis.

Omdat het hierbij om specifiekeantigenen gaat en niet om een mengsel van specifieke enniet-specifieke antigenen, zijn deze assays specifieker voor hetaantonen van infecties met bacteriën van het M.tuberculosis-complex, waaronder M. bovis. Eenuitzondering is de M. bovis-BCG waarin hetRD1-gebied en dus de genen voor deze specifiekeeiwitantigenen in de IGRA’s ontbreken.IGRA’s tonen wel kruisreactie met enkelenon-tuberculose mycobacteriën (NTM nontuberculeuze mycobacteriën (nontuberculeuze mycobacteriën)), waaronderM.szulgai, M. marinum en M. kansasii.(13,14)

Een positieve THTkan ontstaan door vaccinatie met M. bovis-BCGterwijl de IGRA negatief blijft. Een positieveTHT ontstaan door een M. bovis-infectie geeftwel een positieve IGRA-uitslag. Hierdoor zijnIGRA’s te gebruiken om onderscheid te maken tussengevaccineerde en geïnfecteerde personen bijvoorbeeld in degezondheidszorg of bij laboratorium medewerkers, die in hetverleden (voor 1980) vaker BCG gevaccineerd werden dande algemene populatie.

Casus

In oktober 2007 zagen we een23-jarige vrouw met klachten van een anderhalf jaar bestaandechronische, productieve hoest, niet reagerend op meerdereantibioticumkuren en verminderde eetlust met gewichtsverlies van 10kg kilogram (kilogram). Er was geen sprake van nachtzweten. Patiënte was niet bekendmet TB en was niet in contact geweest met eenTB-patiënt. Ze woont op een boerderij waar vee wordtgehouden, waaronder jaarlingen (pinken). Deze jaarlingen verblijvenmaximaal een half jaar op de boerderij voor de handel. Als kind wasze vaak op bezoek bij haar grootouders, die naast de boerderijwoonden. In deze periode had ze contact met het vee. De laatste 10jaar is ze niet meer in contact geweest met het vee op deboerderij. Verder heeft ze nooit een reis gemaakt naareenTB-endemisch gebied. In haar vrije tijd gaat zenaar de lokale voetbalclub maar komt niet in de kantine. Ook gaatze af en toe naar een regionale dierentuin. Op het moment dat zeklachten kreeg werkte ze in een verpleeghuis, waarop dat momentgeen mensen met TB verbleven. In het verpleeghuis wasniet bekend of er mensen in voorgaande jaren overleden waren aanTB en of er bewoners in het verleden TBhadden gehad. In het verpleeghuis wonen mensen die vooral in detextielindustrie werkzaam zijn geweest.

Bij lichamelijk onderzoek zagenwe een bleke vrouw met een tachycardie en erytheem op haar rug. Hetlaboratoriumonderzoek toonde een licht verhoogde bezinkingssnelheidvan erythrocyten (BSE Bovine Spongiforme Encephalopathie, de zogenaamde ‘gekkekoeienziekte (Bovine Spongiforme Encephalopathie, de zogenaamde ‘gekkekoeienziekte)) van 22 (normaal 20) en eenverhoogde C-reactive protein (CRP C-reactief proteïne (C-reactief proteïne)) van 45mg/l (normaal 0-7½). De THT was 22 mm. DeQFT-GIT was niet aangevraagd. De X-thoraxen de CT-thorax toonden aan beide zijden nodulaireinterstitiële afwijkingen met 2 kleine consolidaties in de rechterbovenkwab en een grote bulla in de linker bovenkwab. Hetlongfunctieonderzoek was normaal, afgezien van een licht verlaagdediffusiecapaciteit voor koolstofmonoxide (DLCO).

Er werd een bronchoscopieverricht en histopathologisch onderzoek van de linker bovenkwabtoonde een granulomateuze ontsteking aan. Zowel deZN-kleuring als de PCR voor M.tuberculosis-complex van de bronchoalveolaire lavage(BAL) waren positief.

De conventionele behandeling,isoniazide, rifampicine, ethambutol en pyrazinamide, voor pulmonaleTB werd gestart. De uitslag van de kweek van deBAL duurde 2 maanden en toonde groei van M.bovis. Na het bekend worden van de kweekuitslagen met M.bovis, die natuurlijke resistentie heeft tegen pyrazinamide,werd de behandeling met zowel pyrazinamide als ethambutolgestaakt.

Contactonderzoek

Naar aanleiding van de positieveZN en PCR van M.tuberculosis-complex startte de GGD eencontactonderzoek volgens het ringprincipe. Hierbij werd gebruikgemaakt van de THT en indien nodig een tweede rondeTHT. De THT-resultaten werdengeïnterpreteerd volgens de Nederlandse richtlijnen. (7) Bij eenpositieve THT werd een aanvullendeQFT-GIT-bepaling verricht.QFT-GIT-resultaten in ons laboratorium zijn positiefals ze groter dan 0.35 U/ml zijn, dubieus tussen de0.20 en 0.35 U/ml en negatief indien kleiner dan 0.20U/ml (15). De contacten van de indexcasus werdenverdeeld in ringen. De 1ste en 2de ring werden tegelijkertijdonderzocht. Door het hoge aantal positieveTHT-uitslagen in de 1ste en 2de ring werd besloten ookde 3e ring te onderzoeken. Ring 1 bevatte 74 personen, bestaandeuit familie en directe collega’s.

AanvullendQFT-GIT-onderzoek werd alleen gedaan bij mensen met een positiefTHT-resultaat. Percentages zijn ten opzichte vanmensen met een positief THT-resultaat. De percentageszijn afgerond waardoor het totaal niet 100% kan zijn.

Van hen hadden 24 een positieveTHT-uitslag. Van deze 24 hadden 7 een positieveQFT-GIT-uitslag, 3 een dubieuze uitslag en 10 haddeneen negatieve QFT-GIT-uitslag. Vier van de 24 personenwerden niet onderzocht met een QFT-GIT. Ring 2 bestonduit 31 collega’s die minder contact hadden met de patiënt. Zevenvan hen hadden een positieve THT. Daarvan hadden 5 eennegatieve QFT-GIT en waren 2 niet gescreend. Ring 3bestond uit 30 collega’s welke in andere gebouwen van hetverpleeghuis werkten. Hiervan hadden 2 een positieveTHT. Eén van de 2 personen had ook een positieveQFT-GIT en de ander had een negatieve uitslag. Depersoon met de positieve QFT-GIT had nooit contactgehad met onze patiënte. ( Tabel 1) AanvullendQFT-GIT-onderzoek werd alleen gedaan bij mensen meteen positief THT-resultaat. Percentages zijn tenopzichte van mensen met een positief THT-resultaat. Depercentages zijn afgerond waardoor het totaal niet 100% kan zijn.De bewoners van het verpleeghuis, met wie de patiënte werkte,werden ook onderzocht vanwege de ontstane onrust. Gezien hunleeftijd en de daarbij behorende hoge prevalentie vanTB werden zij alleen onderzocht met eenQFT-GIT. In totaal werden 40 personen gecontroleerd.Drie van hen hadden een positief resultaat, 3 een dubieus resultaaten 34 een negatief resultaat. Van alle in het contactonderzoekingesloten personen vertoonde niemand tekenen van actieveTB. De personen uit de eerste 3 ringen met eenpositieve QFT-GIT-uitslag werden 6 maanden behandeldmet Isoniazide volgens de richtlijn Behandeling LatenteTuberculose-infectie. (16) De bewoners van het verpleeghuismet een positieve uitslag van de QFT-GIT werden nietbehandeld. De huisarts werd geïnformeerd en erop gewezen om extraalert te zijn bij klachten die kunnen passen bij actieveTB.

Onderzoek van de veestapelvoor bovine TB

Conform het overheidsbeleid ingeval van (mogelijk) tuberculose bij dieren werd vervolgonderzoekgedaan naar bovine TB bij de jaarlingen op deboerderij van de familie van de indexpatiënte. Dit onderzoek werdverricht ondanks het feit dat de patiënte al meer dan 10 jaar geencontact meer had gehad met de veestapel op de boerderij en ondankshet feit dat de jaarlingen ieder half jaar de boerderij verlieten.De THT’s waren negatief bij alle dieren, op één na.Dit dier werd geëuthanaseerd voor sectie. Bij deze sectie werdengeen aanwijzingen voor een TB-infectie gevonden en ookna 6 maanden was de kweek voor het aantonen van M.bovisnegatief.

Genotypering van het isolaatvan het sputum van de patiënt

Sinds 1993 vindt van alle M.tuberculosis-complexisolaten van patiënten in Nederlandgenotypering plaats binnen het handvest van de nationalesurveillance van tuberculoseprojecten en om het contactonderzoek teondersteunen. Patiënten met isolaten met identieke DNA deoxyribonucleic acid (deoxyribonucleic acid)fingerprints worden doorgegeven aan de GGD, die mogelijke(epidemiologische) verbanden tussen deze patiënten onderzoekt. (17)Op alle isolaten werd IS6110 restrictie fragmentlengte polymorfisme (RFLP Restriction Fragment Length polymorphism (Restriction Fragment Length polymorphism))-typering verricht en bijminder dan 5 kopieën van IS6110 vindt ookRFLP-typering met polymorfe GC-rijke sequenties(PGRS) plaats. Op verzoek wordt spoligotyperingverricht. (18-21).

Figuur1 Vergelijking van, PGRS- RFLP- enspoligotypering IS6110 RFLP-patronen vanM. bovis-isolaten van 4 Nederlandse patiënten en van dereferentiestam M. bovis BCG-P3.

Nummer 1 geeft deDNA-fingerprintresultaten van het M. bovis-isolaat vande indexpatiënte weer . Nummers 2,3 en 4 zijn patiënten waarbij eenM. bovis is geïsoleerd. Nummers 1 en 2 hebben een vrijwel identiekPGRS-RFLP-patroon, namelijk groter dan 96%overeenkomst, en deze 2 stammen komen voor 85% overeen met nummer3. De 3 isolaten zijn identiek in de spoligotypering maar zijnverschillend in de IS6110 RFLP. Nummer 4heeft een ander PGRS-RFLP- en spoligopatroon dan deandere isolaten maar heeft een IS6110RFLP-patroon identiek aan dat van nummer 1. Referentieis een M. bovis BCG-referentiestam

Om een mogelijke menselijkeoverdracht van de infectie te onderzoeken, werd genotypering van degeïsoleerde stam van onze patiënte verricht met IS6110RFLP. Het IS6110RFLP-patroon liet 2 banden zien, waarvan één met eengrootte van 1.9 kb, hetgeen karakteristiek is voor M.bovis. (20) Vanwege dit resultaatwerd ook dePGRS-RFLP-typering verricht. Gezien de interesse indeze casus werd aanvullend ook spoligotypering uitgevoerd. Navergelijking met alleIS6110/PGRS-RFLP-patronen van M.tuberculosis-complexisolaten sinds 1993 uit de Nederlandsedatabank, bleek dat de combinatie van de fingerprintresultaten vanhet isolaat van onze patiënte uniek was. (Figuur 1). Er was éénIS6110/RFLP-patroon in de database met 2IS6110-banden die identiek was aan hetIS6110 /RFLP-patroon van het isolaat van onzepatiënte, maar de PGRS-RFLP- en spoligotyperingresultaten van debetreffende stam waren heel verschillend. Verder was er 1 isolaatdat qua PGRS-RFLP vrijwel identiek was aan het isolaatvan onze patiënte en een spoligopatroon had dat 100% identiek was.(Figuur 1) Deze M. bovis-stam werd geïsoleerd bij een69-jarige patiënt van Nederlandse afkomst, waarvan men dacht dathij een reactivatie ondervonden had van een infectie die hij langgeleden had opgelopen door het drinken van geïnfecteerde melk.Gezien de typeringsresultaten werd een verband tussen onze patiënteen deze 69-jarige patiënt, of mogelijk een nooit geïdentificeerdebewoner van het verpleeghuis, aannemelijk bevonden.

Discussie

Sinds 1999 is de veestapel inNederland officieel vrij van bovine TB. Af en toe zijner kleine uitbraken van bovine TB in rundvee of dierenin een dierentuin. (22,23) Ondanks het (erg) lage risico op eenbovine TB-infectie werd een jonge Nederlandse vrouwgediagnosticeerd met een M. bovis-infectie. Ondanksuitgebreid onderzoek kon de bron van deze M.bovis-infectieniet worden aangetoond. Transmissie via dieren was ergonwaarschijnlijk. Er kon geen verband worden gevonden tussen deM. bovis-infectie van onze patiënte en de veestapel van deboerderij waar zij woonde. Het vee dat in de periode van onzeeerste contacten met de patiënte op de boerderij was werd getest opbovine TB met behulp van de huidtest. Er waren bij deveterinaire inspectie geen gegevens bekend over met TBgeïnfecteerd vee op deze boerderij. De patiënte bezocht regelmatigdezelfde dierentuin en had de infectie ook via de daar aanwezigedieren kunnen opgelopen. Echter de betreffende dierentuin was delaatste 20 jaar niet geassocieerd met bovine TB.

Uit het contactonderzoek bleekdat geen van de onderzochte contacten met een positieveTHT- of QFT-GIT-resultaat verschijnselenhad van actieve TB. Hierdoor kon ook geen bron van deinfectie onder hen gevonden worden. Voor verder onderzoek werden deDNA fingerprints van het M. bovis-isolaat vande patiënte vergeleken met DNA fingerprints van M.tuberculosis-complexstammen uit de de Nederlandse databank.Hierin kon geen 100% match gevonden worden.

Door de sterke overeenkomsttussen de DNA fingerprints van het isolaat van onze casus en dievan een oude Nederlandse patiënt uit de databank werd deze patiëntals bron mogelijk geacht. Dit uitsluitend op grond van deDNA-fingerprintgegevens van PGRS-RFLP, want er kon geenepidemiologisch verband worden aangetoond. Ook zou onze patiëntenog geïnfecteerd kunnen zijn in het bejaardentehuis door eenniet-geïdentificeerde M. bovis-bron. Als laatste mogelijkheidblijft, ons inziens, het drinken van ongepasteuriseerde melk over.In de gebieden waar zij woont, wordt namelijk de melk nog frequentzo gedronken.

Conclusie

Bron- en contactonderzoek bij eenM. bovis-infectie blijft zinvol. De huidige tendens inNederland is om mensen met een positieve THT en eennegatieve QFT-GIT nog niet preventief te behandelenmet isoniazide. Bij deze populatie wordt voorlopig een afwachtendbeleid gevoerd. Echter bij mensen met zowel een positiefTHT als een positief QFT-GIT-resultaatwordt behandeling voor latente TB geadviseerd.

In onze casus werd direct na dediagnose van pulmonale TB, bij verdenking op een M.tuberculosis-infectie gestart met contactonderzoek. Twee maandenlater, na het bekend worden van de kweken, bleek de pulmonaleTB te berusten op een M. bovis-infectie.Doordat contactonderzoek met zowel de THT als deQFT-GIT werd verricht, kunnen we de resultaten vandeze 2 testen vergelijken. In de beschreven casus zijn 6 personenmet een positief THT-resultaat niet getest met deQFT-GIT. Zoals beschreven in tabel 1 waren er bij demensen met een positieve THT-uitslag, die wel getestwaren met een QFT-GIT, hoge percentages negatieveQFT-GIT-uitslagen. Deze resultaten ondersteunen detheoretisch hogere specificiteit van de QFT-GIT vooreen M. bovis-infectie zoals de QFT-GIT ingeval van M. tuberculosis-infecties. (10,11). Hierdoor isde QFT-GIT in dit contactonderzoek ook bruikbaargebleken als methode om te screenen bij bron- en contactonderzoekrondom een patiënt met M. bovis.

Auteurs

O.Akkerman1, A. van der Zanden2,D. Nijmeijer3, K. van der Loo4, R. Beldman4, D. Bakker5, D. vanSoolingen6,7, K. Kremer6, B. Mulder2

1. Afdeling longziekten, Medisch Spectrum Twente, Enschede
2. Laboratorium microbiologie Twente Achterhoek, Enschede
3. Afdeling Longziekten, Streekziekenhuis Koningin Beatrix,Winterswijk
4. Afdeling tuberculosebestrijding, GGD Gelre-IJssel,Apeldoorn/ Doetinchem
5. Afdeling bacteriologie en TSE’s, CentralVeterinary Institute, Lelystad
6. Tuberculose Referentie Laboratorium, CIb Centre for Infectious Disease Control (Centre for Infectious Disease Control), RIVM,Bilthoven
7. Universitair Medisch Centrum St. Radboud, Nijmegen

Correspondentie:

O. Akkerman | onnoakkerman@gmail.com

Literatuur

1. Griffith AS. Bovine tuberculosis in man. Tubercle 1937; 18:529–543
2. Smith RM risicomanagement (risicomanagement), Drobniewski AF. Gibson JD Creutzfeldt-Jakob (Creutzfeldt-Jakob) et al. Mycobacterium bovisinfection, United Kingdom. Emerg. Infect. Dis. 2004;10:539–541.
3. Sunder S, Lanotte P, Godreuil S et al. Human-to-HumanTransmission of Tuberculosis Caused by Mycobacterium bovis inImmunocompetent Patients. J. Clin. Microbiol 2009, Vol. 47(4):1249–1251
4. Evans, JT, Smith EG Europese Gemeenschap (Europese Gemeenschap), Banerjee A et al. Cluster of humantuberculosis caused by Mycobacterium bovis: evidence forperson-to-person transmission in the UK United Kingdom (United Kingdom). Lancet 2007;369:1270–1276
5. Blazquez J, de Los Monteros LEE, Samper S, et al. Geneticcharacterization of multidrug-resistant Mycobacterium bovis strainsfrom a hospital outbreak involving human immunodeficiencyvirus-positive patients. J Clin Microbiol 1997; 35:1390–1393.
6. Erkens CGM, Kalisvaart NA, Slump E, Sebek M, van Soolingen D.Tuberculose in Nederland 2007. Surveillancerapport, KNCV Koninklijke Nederlandse Centrale Vereniging (voor tuberculosebestrijding) - Tuberculosis Foundation (Koninklijke Nederlandse Centrale Vereniging (voor tuberculosebestrijding) - Tuberculosis Foundation)Tuberculosefonds, Den Haag jan 2009. ISBN nr 978-90-77865-09-5
7. Majoor CJ, Magis –Escurra C, van Ingen J, Epidemiology ofMycobacterium bovis disease in The Netherlands from 1993-2007.Accepted for publication Emerging Infectious Diseases
8. Veen J. 1992. Microepidemics of tuberculosis: thestone-in-the-pond principle. Tuber Lung Dis 73(2):73-6.
9. Richtlijn Tuberculose contactonderzoek 2006, KNCV/CPT Commissie voor Praktische Tuberculosebestrijding (Commissie voor Praktische Tuberculosebestrijding)
10. http://www.ssi.dk/
11. Menzies D, Pai M, Comstock G. Meta-analysis: New Tests for theDiagnosis of Latent Tuberculosis Infection: Areas of Uncertaintyand Recommendations for Research. Ann Intern Med.2007;146:340-354.
12. Pai M, Zwerling A, Menzies D. Systematic Review: T-Cell–basedAssays for the Diagnosis of Latent Tuberculosis Infection: AnUpdate. Ann Intern Med. 2008;149:177-184.
13. Andersen P, Munk ME, Pollock JM Joint meeting (Joint meeting) et al. Specific immune-baseddiagnosis of tuberculosis. Lancet 2000 Sep23;356(9235):1099-104.
14. 14. van Ingen J, de Zwaan R, Dekhuijzen R et al. Region ofdifference 1 in nontuberculous Mycobacterium species adds aphylogenetic and taxonomical character. J Bacteriol. 2009Sep;191(18):5865-7.
15. http://www.cellestis.com/
16. Richtlijn Behandeling Latente Tuberculose Infectie 2006,KNCV/CPT.
17. Lambregts-van Weezenbeek CS, Sebek MM, van Gerven PJ et al.Tuberculosis contact investigation and DNA fingerprint surveillancein The Netherlands: 6 years’ experience with nation-wide clusterfeedback and cluster monitoring. Int J Tuberc Lung Dis. 2003Dec;7(12 Suppl 3):S463-70.
18. van Embden JD, Cave MD, Crawford JT, Dale JW, Eisenach KD,Gicquel B, Hermans P, Martin C, McAdam R, Shinnick TM, et al.Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNAfingerprinting: recommendations for a standardized methodology. JClin Microbiol. 1993 Feb;31(2):406-9.
19. Kremer K, van Soolingen D, Frothingham R et al. 1999.Comparison of methods based on different molecular epidemiologicalmarkers for typing of Mycobacterium tuberculosis complex strains:Interlaboratory study of discriminatory power and reproducibility.J. Clin. Microbiol. 37:2607-2618.
20. Otal I, Gomez AB, Kremer K et al. Mapping of IS6110 insertionsites in Mycobacterium bovis isolates in relation to adaptationfrom the animal to human host. Vet Microbiol. 2008 Jun22;129(3-4):333
21. Kamerbeek J, Schouls L, Kolk A et al. Simultaneous detectionand strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis fordiagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol.1997Apr;35(4):907-14
22. Leerboek der Tuberculosebestrijding, 13e druk. KoninklijkeNederlandse Centrale Vereniging tot Bestrijding der Tuberculose. ‘sGravenhage 1984.
23. Veling J, Verhoeff J, Bosch JC et al. An outbreak of bovinetuberculosis on a dairy farm. Tijdschr Diergeneeskd. 1993 Sep1;118(17):541-4.